Флуоресцентні Барвники BARVA NA

Для швидкої та зручної пост-електрофоретичної візуалізації ДНК на агарозних та поліакриламідних гелях «Отава» пропонує високоефективні флуоресцентні барвники BARVA NA Green і BARVA NA Orange, перевагами яких є:

• висока чутливість, що більш ніж у 20 разів перевищує чутливість бромистого етидію і дає змогу визначати ДНК на гелях у кількості 0,5 нг на смугу;
• проста та швидка процедура фарбування;
• сумісність зі стандартним лабораторним обладнанням: візуалізація за допомогою стандартного 300-нм УФ-трансілюмінатора чи джерела видимого світла (Dark Reader, 470 нм);
• значно менша, порівняно з бромистим етидієм, мутагенність і токсичність;
• низька вартість для споживачів порівняно з вартістю SYBR Green I.

BARVA NA Green і BARVA NA Orange постачаються в концентрації 2,000X (розчин у ДМСО).

Рис. 1. ДНК в агарозному гелі, пофарбована барвниками SYBR Green I, BARVA NA Orange, BARVA NA Green і бромистим етидієм. Гель витримувався в розчині барвника близько 40 хв. Збудження проводилось за допомогою видимого (DarkReader, максимум випромінювання близько 460 нм) та ультрафіолетового (302 нм) трансілюмінаторів. 

BARVA NA Green і BARVA NA Orange постачаються в концентрації 2,000X (розчин у ДМСО).

Зберігання

У захищеному від світла місці при температурі від -4 °C до -20 °C розчин барвника в ДМСО може зберігатися упродовж одного року.

Перед використанням розчин барвника нагрівають до кімнатної температури до повного танення ДМСО й утворення гомогенного розчину. В літературі немає посилань на мутагенність барвників цього класу, проте відомо, що ДМСО як розчинник сприяє проникненню органічних молекул у живі тканини. Тому під час роботи зі стоковими розчинами барвників слід використовувати гумові рукавички. Водні розчини барвників безпечні.   

Спектральні властивості барвників

Завдяки своїм спектральним характеристикам (рис. 2) BARVA NA Green та BARVA NA Orange можуть використовуватися з широкою низкою  різноманітних приладів для візуалізації та сканування гелів, починаючи від ультрафіолетових епі- та трансілюмінаторів до сканерів, джерелами збудження в яких є аргоновий лазер або ртутна лампа.

Рис. 2. Спектри збудження (зліва) та випромінювання (справа) флуоресценції розчинів барвника BARVA NA Orange у присутності ДНК.

Фарбування ДНК після електрофорезу

1. Буфери TBE (89 mM Tris основи, 89 mM борної кислоти, 1 mM EDTA, pH 8) та TAE (40 mM Tris-ацетат, 1 mM EDTA, pH 8) можуть використовуватися для пост-електрофоретичної візуалізації ДНК барвниками BARVA NA Green чи BARVA NA Orange.

2. Стоковий розчин BARVA NA Green чи BARVA NA Orange розводять буфером у співвідношенні 1:2000. З цією метою аліквоту барвника додають до фарбувального розчину, оптимальний pH якого знаходиться в межах 7.5-8 (бажано ближче до 8).

3. Гель поміщають у фарбувальний розчин та витримують при кімнатній температурі 30-40 хв. Для фарбування рекомендують використовувати пластикові контейнери, оскільки скляні адсорбують барвник з розчину. Контейнер потрібно захистити від світла за допомогою алюмінієвої фольги чи помістити його в темне місце.

Фарбування проводять при кімнатній температурі, його час залежить від товщини гелю та процентного вмісту агарози чи поліакриламіду. Після фарбування не слід відмивати гель від надлишку барвника. Фарбувальний розчин можна зберігати в темному місці (краще в холодильнику) протягом тижня та використовувати двічі-тричі.

Фотографування гелів

УФ-трансілюмінатори чи джерела блакитного світла можуть бути використані для візуалізації ДНК на гелях, забарвлених BARVA NA Green чи BARVA NA Orange. Для фотографування гелів найкраще використовувати зелені (для BARVA NA Green) чи жовті (для BARVA NA Orange) фільтри. Не слід застосовувати червоні фільтри, що використовуються для фотографування гелів, забарвлених бромистим етидієм.

Фотографування гелю є важливим для отримання високої чутливості, адже інтегрувальний ефект фотоапарата може зробити помітними смуги, яких не видно неозброєним оком. Гелі, забарвлені BARVA NA Green та BARVA NA Orange, мають незначну інтенсивність фонової флуоресценції, що дозволяє фотографувати з великим часом експозиції. Оптимальний час експозиції залежить від інтенсивності джерела опромінення, а також від типу фотоапарата. При діафрагмі 4.5 для BARVA NA Green та BARVA NA Orange він, як правило, становить від 1 до 2 с. Проте при використанні менш потужних джерел випромінювання слід відповідно збільшувати час експозиції.

Література

Соловйов О.О., Лівшиць Л.А., Ковальська В.Б., Лосицький М.Ю., Сломінський Ю.Л., Ярмолюк С.М. Новий високочутливий флуоресцентний барвник Barva NA для візуалізації ДНК після денатуруючого градієнтного гель-електрофорезу // Ukrainica Bioorganica Acta. – 2006. – 4, № 1. – С. 30-33.

www.bioorganica.org.ua